④放射免疫分析

放射免疫分析(radioimmunoassay，农药RIA)是残留由Yalow R·S·和Berson S．A．于1954年创建的。该法利用放射性同位素(常用³H、酶的免¹²⁵I、活性³²P等)标记抗原或抗体，抑制疫分通过检测放射性强度对抗原或抗体进行示踪和检测，免疫具有检测灵敏度高(检测限达ng至pg甚至fg级)、分析特异性强、技术简便实用的析法优点。但放射性同位素标记要在特殊的农药实验室中进行，标记较困难，残留标记和分析中易造成放射性污染。酶的免此外，活性由于放射性元素有一定半衰期，抑制疫分易自行衰减且难以保存，免疫检测时需要特殊的仪器设备，在农药残留分析中的应用受到很大限制，甚至趋向于被淘汰。

2、酶免疫分析

酶免疫分析法(erzyme immunoassay，EIA)是Engrall等人于1966创建的。该法用特定的酶(如过氧化物酶、碱性磷酸酯酶等)来标记抗原或抗体，利用抗原抗体反应的特异性和酶催化显色反应的高效性对抗原抗体反应进行示踪和检测。常用酶免疫分析包括酶抑制法(erlzynle inhibition，EI)、酶放大免疫检测法(enzyme—multipledimmlmoassay techniqtle，EMIT)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。

(1)酶抑制法：此法利用特定的酶标记抗原或抗体，酶标记物在形成抗原抗体复合物时，酶活性降低，通过测定酶活性的变化对抗原抗体反应进行检测。酶抑制法是一种均相免疫分析方法，方法简便，既可以用于检测抗体，也可以用于检测抗原，但其灵敏度较低。

(2)酶放大免疫检测法：此法将酶标记农药半抗原、待测农药及抗体加入反应管进行竞争结合反应，离心去除结合物，上清液中剩余的酶标农药半抗原量与待测农药含量呈正比。

在上清液中加入酶的底物和显色剂，酶促显色反应强度与待测农药含量呈正比。酶放大免疫检测法不用固相载体，重复性好，检测速度快。

(3)酶联免疫吸附测定法：酶联免疫吸附测定法是将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种敏感性很高的非均相免疫分析技术。将抗原或抗体固定于固相(如聚苯乙烯微孔板表面)，抗原抗体反应平衡后，洗涤除去多余的游离物，结合在固相上的酶标记物催化底物反应使显色剂显色，通过测定酶促显色强度对抗原抗体反应进行检测。在实际应用中，检测大分子抗原多采用双抗体夹心等非竞争模式。检测农药、药物等小分子采用间接竞争酶联免疫吸附测定法、包被抗原直接竞争酶联免疫吸附测定法和包被抗体直接竞争酶联免疫吸附测定法。

目前已建立了多种有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类等农药的酶联免疫吸附测定法，有些已开发成商品化免疫检测试剂盒。酶联免疫吸附测定法是目前应用最多的农药残留免疫分析技术。

3、荧光免疫分析

荧光免疫分析(fluorescerlce immurtoassa3r，FIA)包括荧光标记免疫分析和酶标记荧光免疫分析。荧光标记免疫分析是用特定的荧光物质标记抗原或抗体，利用抗原抗体反应的特异性和荧光检测的高敏感性对抗原抗体反应进行示踪和检测。经典的荧光免疫分析以有机荧光分子为标记物，常用的有异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocya-nate，FITC)、四甲基异硫氰酸罗丹明(tetramethyl rh(Marnine isothic)cyanate，TRITC)等。酶标记荧光免疫分析是在酶标记免疫分析中用荧光底物代替生色底物，是目前非放射免疫分析中灵敏度最高的方法之一。

荧光免疫分析具有灵敏度高、易标记、好保存等优点。但是大多数有机荧光物质的荧光寿命短，在实际应用中由于样品、试剂的自身荧光和激发光的散射等因素，导致背景荧光高，影响了测定的可靠性和灵敏度。

(1)非竞争模式：荧光免疫分析法检测抗体、颗粒性或大分子抗原通常采用非均相反应和非竞争方式，检测方法和原理如下。

①直接法：先固定待测物(含抗原或抗体的样品)，加入荧光标记抗体(或荧光标记抗原)，进行免疫反应。洗涤去除游离物后进行荧光检测。如固相上结合了荧光标记抗体(或荧光标记抗原)，表明固相上有相应的特异性抗原或特异性抗体存在，且荧光强度与相应抗原或相应抗体的量在一定范围内呈正比。

②双抗体夹心法检测抗原：先固定抗体，加入待测物进行反应。洗涤去除游离物后加入荧光标记的第二抗体。洗涤去除游离物后进行荧光检测。如固相上结合了荧光标记物，表明有相应的特异性抗原存在，且荧光强度与待测抗原量在一定范围内呈正比。

(2)竞争模式：农药等小分子化合物的荧光免疫分析通常采用竞争模式，检测方法和原理如下。

①荧光偏振免疫分析：荧光偏振免疫分析(fluorescence polarization immulaoassay，FPIA)是一种利用物质分子在溶液中旋转速度与分子质量大小呈反比的特点检测目标分析物的方法。以适当的荧光物质标记农药半抗原，当荧光标记物受到一个平面偏振光照射时，如果分子的长轴与投入的偏振光面平行，吸收的偏振光最多，分子被激发。当激发态分子回到基态时，发射一个偏振光。荧光标记物在溶液中旋转速度越快，发射的偏振光越弱。由于分子旋转的速度与分子质量大小呈反比，因而偏振光减弱的程度与分子旋转的速度呈正比。当荧光标记农药与相应抗体结合后，分子质量显著变大，旋转速度明显减慢，偏振光增强。当待测溶液中有目标分析农药存在时，目标分析农药与荧光标记农药竞争结合抗体，使荧光标记农药与抗体的结合减少，偏振光减弱，减弱的程度与待测农药的浓度在一定范围内呈正比。

②以荧光增强和荧光猝灭为基础的免疫分析：该法利用抗原抗体反应过程中荧光标记物或荧光底物发生荧光增强或荧光猝灭作用来检测抗原或抗体。

荧光偏振免疫分析、以荧光增强和荧光猝灭为基础的免疫分析通常是均相免疫分析，方法简便快速、经济安全，但背景的干扰限制了方法的灵敏度。

③时间分辨荧光免疫分析：时间分辨荧光免疫分析(tlmeresolution fluorescencc、immunoassav，TRFIA)以镧系元素螯合物为荧光标记物或荧光底物，利用标记的TRFIA物或底物的荧光寿命较长的特点，在背景荧光消失后测定标记物或底物的荧光强度，可有效降低背景荧光的干扰，显著提高荧光免疫分析的灵敏度，是20世纪80年代免疫分析的一个重要突破。

4、化学发光免疫分析

化学发光是利用化学反应过程中产生的内能激发化学发光剂(常用鲁米诺及其衍生物)发光。化学发光免疫分析(chemilumirlescence lmmunoassay，CLIA)是把化学发光的高灵敏度与免疫分析的高选择性结合起来的微量免疫分析技术，包括化学发光标记免疫分析、酶标记化学发光免疫分析(底物发光免疫分析)等。

(1)化学发光标记免疫分析：化学发光标记免疫分析的原理和反应模式与放射免疫分析基本相同，只是用化学发光剂代替同位素标记抗原或抗体。化学发光剂标记的抗原或抗体与待测抗体或待测抗原反应后经分离、洗涤等步骤，最后通过测定发光强度来确定待测物的含量。

(2)酶标记化学发光免疫分析：酶标记化学发光免疫分析的原理和反应模式与酶联免疫吸附测定法基本相同，只是用化学发光剂代替显色剂，以检测化学发光代替比色测定。

化学发光免疫分析的检测灵敏度可以与放射免疫分析媲美，方法简便快速。目前，化学发光免疫分析存在的主要问题是被测样品中其他物质的背景干扰大，影响定量测定结果的准确度。

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